2.3 Експериментальна частина

2.3.1 Розділення білків пшениці на окремі фракції в залежності від розчинності

Основну масу білків зерна становлять прості білки – це так звані запасні білки. Вони накопичуються в зерні, яке достигає, і є необхідними для живлення зародка на початкових етапах проростання. Найбільш повноцінними є білки зародка, в яких сприятливо збалансовані незамінні амінокислоти. Білок зародка наближається за своїм амінокислотним складом до білків тваринного походження.

Амінокислотний склад сумарних білків злакових культур визначається амінокислотним складом окремих фракцій, в основу класифікації яких покладений принцип розчинності. Під час послідовної обробки борошна або розмеленого зерна водою, 5...10%-ним розчином хлориду натрію, 60...80%-ним водним розчином спирту і 0,1...0,2%-ним розчином гідроксиду натрію екстрагуються білкові фракції, які відповідно названі альбумінами, глобулінами, проламінами і глютелінами. В таблиці 2.4 наводиться процентний вміст білкових фракцій в зернових культурах. До складу білків входять і так звані склеропротеїни (нерозчинні білки), що містяться в оболонках і периферійних шарах зерна. Особливістю білків даної фракції є міцне сполучення з лігнінополісахаридним комплексом. Склеропротеїни виконують структурну функцію і є малодоступними для травлення. Поряд з білками в зерні міститься небілковий азот (0,7...12,9% від загального азоту), що включає вільні амінокислоти (50...60%), пептиди, нуклеотиди й ін. Кількість небілкового азоту змінюється в залежності від ступеня зрілості, вирівнюваності і проростання зерна. 

Таблиця 2.3 – Вміст білкових фракцій в зерні злакових 

Білки зернових нерівномірно розподілені між анатомічними частинами зерна. Значна кількість білка міститься в ендоспермі (65…75%) і значно менша – в алейроновому шарі (до 15,5%) і зародку (до22%). Білки зародка  і алейронового шару представлені в основному альбумінами і глобулінами, що виконують каталітичну функцію під час проростання зерна (ферменти), а білки ендосперму – альбумінами, глобулінами, проламінами і глютелінами.

Сумарний вміст білка в пшеничному зерні становить 11,4%. Найбільше в ньому мітиться проламінів і глютелінів, що утворюють клейковину. Проламін пшениці називають гліадином. Він найкраще розчиняється в 60% етанолі. Ізоелектрична точка відповідно рН=7,0. Амінокислотний склад гліадину відрізняється малим вмістом незамінних амінокислот – триптофану і лізину. Разом з тим багато глутамінової кислоти (46,6%) і проліну (17,0%). Глютелін пшениці називають глютеніном. За амінокислотним складом він відрізняється від гліадина, але також містить багато глутамінової кислоти.

Альбумін, що міститься в пшеничному зерні був названий лейкозином. Він містить головним чином у зародку. Цей білок легко денатурується і втрачає свою розчинність.

Важливою складовою зерна є клейковина. Вміст клейковини в зерні і борошні пшениці є важливим показником якості. Сира клейковина містить 66% води і 34% сухої речовини, яка в основному складається з білків. Від кількості і реологічних властивостей клейковини залежить здатність пшеничного борошна давати в процесі випічки пишний хліб з пружним, еластичним і пористим м’якушем.

Клейковина є складним білковим комплексом, що складається із двох фракцій – гліадинової і глютенінової в співвідношенні 1:1. Окремо ці фракції властивостями клейковини не володіють. Разом з тим гліадин лекго відділяється від глютеніну шляхом екстракції 60...70% етанолом. Це свідчить про те, що обидві фракції з’єднані нековалентними зв’язками.

В кількісному співвідношенні основними білками пшениці є дві фракції, що здатні утворювати клейковину - гліадин (проламіни пшениці) та глютенін (глутеліни пшениці).

Прилади, обладнання, матеріали: скляна воронка, порцелянова ступка, товкачик, фільтрувальний папір, технічні ваги, годинник, центрифуга, конічна колба місткістю 150…200 см3, пробірки, піпетка місткістю 1 см3, циліндр місткістю 10 см3, водяна баня, термометр, зразок борошна.

Реактиви: дистильована вода, 10 %-й та насичений розчини NaCl, сухий тонкоподрібнений порошок (NH4)2SO4, 0,2 %-й розчин NaOH, 0,1 н* розчин СН3СООН, біуретовий реактив**.

Примітки.*Таке позначення розмірності молярної концентрації еквіваленту СН, замість позначення "моль-екв/дм3" буде використовуватись в даній методичці. Молярна концентрація еквіваленту – це кількість молів еквівалентів розчиненої речовини в 1 дм3 розчину, мольeкв/дм3.

 **Біуретовий реактив: 15 см3 10 М розчину КОН та 25 г сегнетової солі, яку беруть з похибкою  ± 0,01г, розчиняють приблизно в 900 см3 дистильованої води в мірній колбі місткістю 1000 мл, повільно додають під час постійного перемішування 30 см3  4 %-ного розчину CuSO4, відміряних циліндром, та доводять об’єм колби до мітки дистильованою водою.

Інший спосіб приготування біуретового реактиву: В 500 см3 води розчиняють 1,5 г сульфату міді (CuSO4∙5H2O) і 6,0 г змішаного тартрата натрію-калію (NaKC4H4O6∙4H2O). За інтенсивного перемішування додають 300 см3 10%-ного розчину NaOH (вільного від карбонатів). Для запобігання утворення осаду оксиду купруму (І) можна додати також KJ (1 г). Об’єм суміші доводять водою до 1000 см3; суміш зберігають в пластиковій пляшці.

Виділення білків пшениці, розчинних у воді.

Послідовність дій наведена на схемі (рисунок 2.11) 2 г пшеничного борошна розтирають у фарфоровій ступці з 10 см3 дистильованої води. Отриману суміш залишають у спокої на 2…3 хв, потім відфільтровують. Залишок борошна промивають два рази невеликими порціями дистильованої води та залишають для подальшого вилучення глобулінів пшениці. Отриманий фільтрат використовують під час дослідження розчинності альбумінів пшениці.

Рисунок 2.11 – Схема виділення розчинних у воді, розчинах солей і лугах білків пшениці

До фільтрату альбумінової фракції         білків додають сухий тонкоподрібнений порошок сульфату амонію під час нагрівання (не вище 40°С) до повного насичення (до припинення розчинення сульфату амонію).

Осад, що випав у вигляді альбумінової фракції білків пшениці, відфільтровують. Осад на фільтрі розчиняють в 1 см3 дистильованої води. В отриманому розчині підтверджують наявність білків, додавши до нього 1 см3 біуретового реактиву.

Виділення білків пшениці, розчинних у солях

Промитий водою залишок борошна (після вилучення альбумінової фракції білків) розтирають у ступці з 10 см3 10%-ного розчину хлориду натрію, залишають у спокої на 2…3 хв. та відфільтровують. Залишок борошна промивають два рази невеликими порціями свіжого розчину хлориду натрію та залишають для подальших дослідів. Отриманий фільтрат використовують під час дослідження розчинності глобулінів пшениці.

До фільтрату додають однаковий об’єм насиченого розчину хлориду натрію, досягнувши таким чином напівнасичення. Осад, що випав у вигляді глобулінової фракції білків пшениці, відфільтровують. Осад розчиняють на фільтрі в 1 см3 10%-ного розчину хлориду натрію. Проводять реакцію з біуретовим реактивом.

Виділення білків пшениці, розчинних у лугах

Залишок борошна (після вилучення альбумінової та глобулінової фракцій білків) розтирають у фарфоровій ступці з 10 мл 0,2%-ним розчином гідроксиду натрію, залишають у спокої на 2…3 хв. та відфільтровують. До фільтрату додають по краплям 0,1 н розчин оцтової кислоти. Осад, що випав, являє собою глютенін (глутеліни пшениці). Послідовність виконання дій представлена на рисунку 2.11.

Виділення білків пшениці, розчинних у спиртах

У фарфоровій ступці розтирають 1 г пшеничного борошна з 5 см3 70%-ного етилового спирту. Отриману суспензію залишають у спокої та відфільтровують. До 3 см3 фільтрату додають по краплям дистильовану воду до випадіння осаду. Отриманий осад являє собою гліадин (проламіни пшениці). Послідовність виконання дій представлена на рисунку 2.12.

Рисунок 2.12 – Схема виділення білків, розчинних у спиртах

2.3.2 Розділення білків молока на окремі фракції в залежності від розчинності

Вміст білків в молоці становить 2,9…3,5 %. Білки молока забезпечують нормальний розвиток організму та харчування дорослої людини. Вони відрізняються за будовою, фізико-хімічними властивостями та біологічними функціями. Білки молока можна поділити на дві групи: казеїн та сироваткові білки. На казеїн припадає приблизно 80% від загального вмісту азоту в молоці, а на сироваткові білки – приблизно 15%. До складу білків молока входять 18 амінокислот, 8 із яких є незамінними.

Казеїн відноситься до фосфопротеїдів та є сумішшю декількох фракцій, що відрізняються за хімічним складом та знаходяться у молоці у вигляді колоїдного розчину. Основною властивістю казеїну є здатність до коагуляції, за якої відбувається руйнування його колоїдного стану. Під час виробництва молочних продуктів коагуляцію казеїну проводять кислотами, сичужним ферментом та хлоридом кальцію.

Сироваткові білки відносяться до глобулярних білків, які на відміну від казеїну не здатні асоціювати та осаджуватися в ізоелектричній точці. Вони гетерогенні, мають важливі біологічні функції. Основну частину сироваткових білків складають β-лактоглобулін та α-лактоальбумін, що містяться у молоці в тонкодиспергованому стані.

β-Лактоглобулін – найважливіший білок в кількісному відношенні, термолабільний. Він бере участь у транспортуванні вітаміну А, переносить в кишковик макро- та мікроелементи, вітаміни, ліпіди. Теплова денатурація призводить до коагуляції агрегованого білка (він коагулює майже повністю за температури 85…100 °С ) та утворення комплексів з казеїном.

α-Лактальбумін – гетерогенний білок, бере участь в синтезі лактози (є частиною лактозосинтезуючої системи). Потрапляє в молоко з кровоносної системи тварини. Він найбільш термостабільний з усіх сироваткових білків внаслідок присутності в ньому дисульфідних зв’язків. Під час охолодження та в присутності іонів кальцію α-лактальбумін здатен відновлювати нативну структуру на 80…90%.

Молочні альбуміни та глобуліни мають властивості білків відповідних груп: вони згортаються під час кип’ятіння та висолюються насиченим (альбуміни) і напівнасиченим (глобуліни) розчином сульфату амонію.

Завдяки значному вмісту незамінних амінокислот білки молока є повноцінними. Особливо багаті на незамінні амінокислоти сироваткові білки, в яких вміст таких дефіцитних амінокислот як лізин, триптофан, метіонін та треонін є найвищим. Білки молока мають високу засвоюваність (95...96 %). Небілкові азотисті сполуки містяться у молоці в незначних кількостях.

Прилади, обладнання, матеріали: скляна воронка, фільтрувальний папір, годинник, конічна колба місткістю 150…200 см3, пробірки, піпетка місткістю 1 см3,
2 см3, 5 см3, водяна баня, термометр, центрифуга.

Реактиви: молоко, дистильована вода, 1 %-ний розчин NaCl, сухий тонкоподрібнений порошок (NH4)2SO4, розчин (NH4)2SO4, сухий NaHCO3, 1 %-ний розчин NaOH, 3 %-й розчин CH3COOH, біуретовий реактив.

Виділення казеїну

В колбу об’ємом 100 см3 наливають 5 см3 молока та 5 см3 дистильованої води (рисунок 2.13). Вміст колби ретельно перемішують та додають по краплям 1 см3 3 %-ного розчину оцтової кислоти. Отриману суміш знову перемішують та залишають у спокої на 5…10 хв. Осад казеїну відфільтровують. Отриманий фільтрат (сироватка), що містить сироваткові білки, нейтралізують, додавши сухий бікарбонат натрію до припинення виділення вуглекислого газу, та використовують для виділення білків молока, розчинних у солях.

Казеїн, що випав в осад, промивають на фільтрі водою та розчиняють в 2 см3 1 %-ного розчину їдкого натру. Присутність білку (казеїнату натрію) в отриманому фільтраті підтверджують за допомогою біуретової реакції. Для цього додають до фільтрату однаковий об’єм біуретового реактиву. Колір розчину повинен змінитися з блакитного на фіолетовий.

Рисунок 2.13 – Схема виділення білків молока:

Виділення білків молока, розчинних у солях

Послідовність виконання дій наведена на схемі рисунку 2.13. В пробірку вносять 1 см3 фільтрату (після виділення казеїну), додають 1 см3 насиченого розчину сульфату амонію (для досягнення напівнасичення). Осад глобулінів молока залишають у спокої на 5…10 хв., а потім відфільтровують. Фільтрат використовують для виділення водорозчинних білків молока. Глобуліни, що випали в осад, розчиняють на фільтрі в 1 см3 1%-ного розчину хлориду натрію. З отриманим розчином глобулінової фракції білків (близько 1 см3) проводять якісну реакцію на пептидний зв'язок, додавши 1 см3 біуретового реактиву.

Виділення білків молока, розчинних у воді

Отриманий після вилучення глобулінів молока фільтрат насичують сухим порошком сульфату амонію, додаючи його під час перемішування. Розчин трохи підігрівають на водяній бані за температури не вище 40°С до припинення розчинення сульфату амонію. Осад, що випав, є альбуміновою фракцією білків молока. Альбуміни відфільтровують, отриманий осад розчиняють на фільтрі в 1 см3 дистильованої води. Проводять якісну реакцію на білок. Послідовність виконання дій наведена на схемі рисунку 2.13.