3.3 Експериментальна частина

3.3.1 Визначення масової частки загального азоту в харчових продуктах методом Кьєльдаля (теоретично)

Прилади, обладнання, матеріали: сито з комірками розміром 0,8 мм, пробірка, зразок продукту, кільце з дроту, аналітичні ваги, колба Кьєльдаля, прилад Чижової, піпетка, спиртівка, водяна баня, циліндри місткістю 10 та 50 см3, каталізатор, витяжна шафа, спеціальна насадка або скляна воронка діаметром 3…4 см, установка для відгонки аміаку* .

Реактиви: дистильована вода, концентрована H2SO4, 0,1 M розчин H2SO4 (або 2 %- ний розчин H3BO3), індикатор, 33 %-ний розчин NaOH, 0,1 М розчин NaOH.

Примітка.*Установка для відгонки аміаку складається із колби місткістю 2 л, скляної трубки довжиною 1 м та діаметром 5…6 мм, воронки для лугу, трійника, гумової трубки з гвинтовим затискачем, воронки, скляних капілярів, краплевловлювача, холодильника, конічної колби місткістю 150…250 мл

Детально методика проведення аналізу білка за методом Кьєльдаля описана в ГОСТі 26889-86 "Продукты пищевые и вкусовые. Общие указания по определению содержания азота методом Кьельдаля".

Наважка для аналізу повинна містити 20…40 мг азоту. Сипкий матеріал (зерно, солод) попередньо подрібнюють так, щоб помел проходив через сито з комірками розміром 0,8 мм.

Для аналізу борошна беруть наважку приблизно 1 г в суху пробірку та зважують з точністю до ±0,0002 г. Потім борошно пересипають в круглодонну колбу Кьєльдаля (V = 200 см3) таким чином, щоб частинки борошна не потрапили на стінки горла колби (рисунок 3.3). Порожню пробірку зважують та за різницею двох зважувань знаходять величину наважки. Аналіз проводять в двох паралельних пробах та водночас беруть дві наважки для визначення масової частки вологи.

В колбу Кьєльдаля (2) додають 1 г розтертої суміші, що складається із сульфату калію і сульфату купруму, взятих у співвідношенні 10:1, і 12 см3 концентрованої сірчаної кислоти. Колбу нещільно закривають порожнинною скляною пробкою грушоподібної форми, під нахилом встановлюють у витяжній шафі на сітці над пальником і нагрівають спочатку на невеликому полум’ї (гази, що виділяються під час згорання, сильно спінюють масу і на початку нагрівання регулюють так, щоб маса не піднімалася в горло колби та не відбувався її викид), а потім більше інтенсивно, доки рідина не почне кипіти (дверцята витяжної шафи повинні бути закритими, а витяжка увімкнутою). Кип’ятіння продовжують до тих пір, доки вміст колби не стане прозорим, світло-зеленого кольору. Після цього кип’ятять ще 30 хв. Потім колбу охолоджують і обережно вливають в неї 30 см3 води, знову охолоджують і приєднують до установки для відгону аміаку (рисунок 3.3).

1 – пароутворювач; 2 – колба Кьєльдаля; 3 – краплевловлювач; 4 – холодильник; 5 – приймач; 6 – крапельна воронка.

Рисунок 3.3 – Схема установки для визначення вмісту азоту методом Кьєльдаля.

Установка для відгону аміаку складається із пароутворювача (1), краплевловлювача (3) з відповідно вигнутими трубками, крапельної воронки (6), холодильника (4) довжиною 10...12 см і конічної колби-приймача на 150…250 см3 (5). Колбу Кьєльдаля (2) закривають пробкою, що має два отвори. В один із них вставляють трубку, яка сполучена з крапельною воронкою і пароутворювачем, в другий – краплевловлювач. Краплевловлювач за допомогою зігнутих трубок з’єднують з холодильником, кінець якого занурений в конічну колбу-приймач, в яку із бюретки відміряють 25 см3 0,1 М розчину сірчаної кислоти (або 25 см3 2 %-ного розчину борної кислоти), додають 3…4 краплі індикатора та підставляють її під холодильник так, щоб кінець його трубки був занурений у розчин кислоти. У крапельну воронку наливають 30…45 см3 30 %-ного розчину лугу. Потім кран крапельної воронки закривають. Коли прилад є зібраним і в холодильник запущена вода, починають нагрівати воду в пароутворювачі. Для рівномірного кипіння в пароутворювач кидають декілька капілярів, запаяних з одного боку. Через 15…20 хв. від початку перегонки аміаку приймальну колбу опускають так, щоб кінець холодильника був вище рівня рідини в колбі і продовжують відгін ще 5 хв. По закінченню перегонки кінець холодильника з промивалки обмивають водою, не виймаючи з колби та титрують надлишок H2SO4 0,1 н розчином NaOH до переходу забарвлення змішаного індикатора** в зелений колір. Титруванням визначається кількість сірчаної кислоти, що нейтралізувалась аміаком, який виділився під час відгонки. При цьому 1 см3 0,1 н розчину гідроксиду натрію відповідає 1,4 г або 0,0014 мг азоту.

Вміст азоту Х, % в перерахунку до сухої речовини розраховують за формулою 

               (3.1)

де a – кількість 0,1 М H2SO4, взята в приймальну колбу для відгонки, см3; b – кількість 0,1 М  NaOH, що пішла на титрування надлишку кислоти, см3; m1 – маса пробірки з наважкою, г; m2 – маса порожньої  пробірки (після  висипання зразка в колбу Кьєльдаля), г; W – маса частка вологи в зразку, %.

У разі використання Н2ВO3 перегонка аміаку ведеться так само, але вміст приймальної колби титрують 0,1 М розчином Н2SO4 до переходу зеленого забарвлення в червоно-фіолетове (в формулі  немає).

Результати аналізу виражають з точністю до 0,01 %, а розходження між двома паралельними дослідами не повинно перевищувати ±0,3 %.

Для перерахунку кількості азоту на суху речовину визначають масову частку вологи експресним методом.

Кількість азоту перераховують на білок множенням отриманої величини на коефіцієнт 5,7 (для пшениці), порівнюють з очікуваним вмістом білка в продукті, встановлюють причини відхилення та його величину.

Примітка.**Найбільш широко використовують метиловий червоний або бромкрезоловий зелений. Можна також використовувати індикатор, відомий під назвою "Таширо"; в нього входить розчин метилового червоного, в який добавлений  метиленовий блакитний. В такому випадку блакитний колір повинен бути взятим в такій пропорції, щоб отримати нейтральне сіре забарвлення за рН 5,5.

3.3.2 Визначення масової частки білкових речовин в харчових продуктах біуретовим методом

Специфічною реакцією на вміст білка є біуретова реакція, оскільки її дають поліпептидні зв’язки. Вона отримала свою назву від похідного сечовини – біурета, який утворює в лужному розчині мідного купоросу забарвлену комплексну сполуку. Інтенсивність забарвлення пропорційна вмісту пептидних зв’язків, а отже, і концентрації білка в розчині.

Біуретову реакцію дають всі білки, пептони та поліпептиди, починаючи з тетрапептидів.

Ця реакція тривалий час використовувалася як якісна реакція на білок. Далі вона стала застосовуватися для кількісного визначення білка в різних об’єктах. Біуретовий метод використовують в різних модифікаціях, які відрізняються умовами екстрагування білка, способами внесення біуретового реактиву та технікою колориметрування.

Нижче наведено біуретовий метод визначення масової частки білка в харчових продуктах модифікації Дженнінгса, експериментальна перевірка якого виявила ряд його переваг перед іншим модифікаціями.

Прилади, обладнання, матеріали: зразок продукту, аналітичні ваги, конічна колба місткістю 250…300 см3, пробка, циліндр місткістю 2 см3, піпетка місткістю
50 см3, механічний струшувач, центрифуга, кювети з товщиною шару розчину 5 мм, фотоелектроколориметр, прилад Чижової.

Реактиви: зразок продукту, тетрахлорметан (CCl4), біуретовий реактив.

Техніка визначення масової частки білкових речовин в харчових продуктах біуретовим методом

Зважують приблизно 1,5 г борошна з точністю до 0,001 г і переносять в суху конічну колбу на 250...300 см3. Відмірюють циліндром, що має ціну поділки 0,1 см3, під витяжкою 2 см3 тетрахлорметану для вилучення жиру із зразка, додають піпеткою 100 мл біуретового реактиву. Закриту пробкою колбу струшують на механічному струшувачі протягом 60 хв. Потім витяжку центрифугують протягом 10 хв. за частоти обертання 4500 хв-1. Прозорий центрифугат переносять в кювети фотоколориметра з товщиною шару розчину 5 мм. Вимірювання оптичної густини проводять за довжини хвилі λ = 550 нм. За величиною оптичної густини білкової витяжки визначають вміст білка в наважці (мг) за допомогою калібрувальної кривої. Розраховують масову частку білка (в %) в перерахунку на сухі речовини борошна.

Послідовність дій визначення масової частки білку в харчових продуктах за допомогою біуретового методу наведена на рисунку 3.4.

Рисунок 3.4 – Схема визначення масової частки білків біуретовим методом

За величиною оптичної густини білкової витяжки визначають вміст білка в наважці (мг) за допомогою калібрувальної кривої (рисунок 3.4).

Розраховують масову частку білка у % на сухі речовини:

                                       (3.2)

де a – кількість білка у взятій наважці, мг; m – маса наважки харчового продукту, г; W – масова частка вологи в продукті, %.

Для побудови калібрувальної кривої (рисунок 3.5) підбирають зразки з різною масовою часткою білка в діапазоні, які зустрічаються в реальних умовах (від 8 до 20 %). Інтервал у вмісті білка зразків повинен знаходитися в межах не більше 1 %. Кількість зразків не повинна бути менше 10. Зі збільшенням їх числа точність визначень зростає.

Потім приведеним вище методом Дженнінгса визначають оптичну густину білкових витяжок всіх зразків.

Будуючи криву на осі абсцис відкладають величини оптичної густини, а на осі ординат – вміст білка в наважці в мг.

Рисунок 3.5. – Калібрувальна крива для визначення масової частки білка біуретовим методом

Таблиця 3.1 - Результати спостережень та розрахунків для визначення масової частки білка в харчовому продукті біуретовим методом

Для перерахунку вмісту білка на суху речовину продукту слід визначити масову частку вологи в ньому експресним методом. Дані оформлюють у вигляді таблиці (таблиця 3.1).

Середнє значення порівнюють з очікуваним вмістом білка в продукті, встановлюють причини розходжень та їх величину.

На основі отриманих результатів роблять висновок про відповідність масової частки білка в продукті вимогам стандарту.

3.3.3 Визначення масової частки білкових речовин в харчових продуктах нефелометричним методом

Метод ґрунтується на вимірюванні інтенсивності світлового потоку, розсіяного твердими або колоїдними частинками, що знаходяться в розчині в підвішеному стані. За інтенсивністю світлорозсіювання, що визначається нефелометром, судять про концентрацію досліджуваної речовини.

В даний час знаходять широке використання фотоелектричні нефелометри.

Розчини високомолекулярних сполук, наприклад розчини білків, здатні за певних умов в присутності деяких хімічних реагентів опалесціювати. Одним з таких реагентів є сульфосаліцилова кислота. Концентрація білка в цьому випадку може бути визначена за інтенсивністю опалесценції.

Продукти гідролізу білка – пептони, амінокислоти та інші азотовмісні речовини – не опалесціюють.

Експериментальною перевіркою встановлено, що нефелометричний метод з використанням сульфосаліцилової кислоти відрізняється швидкістю, високою точністю, простотою та стійкою кореляцією з методом Кьєльдаля.

Прилади, обладнання, матеріали: зразок продукту, аналітичні ваги, конічна колба місткістю 250…300 см3, пробка, бюретка, механічний струшувач, центрифуга, піпетка, мірна колба місткістю 50 см3, кювети з товщиною шару 5 мм, фотоелектричний нефелометр, прилад Чижової.

Реактиви: 0,05 М розчин NaOH, сульфосаліцилова кислота,

Техніка визначення масової частки білкових речовин в харчових продуктах нефелометричним методом

Приблизно 0,5 г досліджуваного борошна зважують з точністю до 0,001 г і переносять в суху конічну колбу на 250...300 см3 з пробкою. В колбу додають із бюретки 50 см3 0,05 н розчину гідроксиду натрію. Закриту пробко колбу встановлюють на механічний струшувач і струшують протягом 15 хв. Потім витяжку центрифугують 10 хв. за частоти обертання 6000 хв-1. Після чого 5 см3 прозорого розчину центрифугату піпеткою переносять в мірну колбу на 50 см3 і вміст колби доводять до мітки сульфосаліциловою кислотою.

У випадку проведення нефелометричного аналізу отримання правильних результатів значною мірою залежить від методики отримання суспензії, а саме від порядку змішування розчинів, швидкості перемішування. Тому після додавання сульфосаліцилової кислоти колбу швидко перевертають 2...3 рази (не більше), розчин наливають в кювету фотоколориметра з товщиною шару розчину 5 мм і вимірюють оптичну густину за довжини хвилі λ = 550 нм. Заміри варто проводити зразу після додавання кислоти, так як частинки білка швидко агрегують. 

Послідовність дій під час визначення масової частки білкових речовин нефелометричним методом наведена на рисунку 3.6.

Масову частку білка визначають за калібрувальною кривою (рисунок 3.7). Побудову її проводять таким же чином, як і у випадку біуретового методу.

Рисунок 3.6 – Схема визначення масової частки білків нефелометричним методом

Масову частку білка визначають за калібрувальною кривою (рисунок 3.7). Побудову її ведуть так само, як і в біуретовому методі.

Рисунок 3.7 – Калібрувальна крива для визначення масової частки білка нефелометричним методом

Дані спостережень та розрахунків заносять до таблиці, яку оформляють аналогічно до таблиці 3.1.

Середнє значення одержаних результатів порівнюють з очікуваним вмістом білка, встановлюють причини та величину відхилення.