10.4 Ферментні препарати

Під час переробки різних видів органічної сировини використовуються ферменти рослинного, мікробного і тваринного походження. Рослинні ферменти специфічні відносно своїх природних субстратів, що визначає високу ефективність їх дії на рослинну сировину. У мікробному світі можна знайти продуцента майже всіх ферментів, що приймають участь в кругообігу органічних речовин. Це пояснює широке застосування мікробних ферментів харчовій промисловості і кормовиробництві. З тваринної сировини отримують обмежений асортимент ферментних препаратів які, як дорожчі, застосовуються рідше за мікробних.

Ферментні препарати на відміну від ферментів містять окрім активного ферменту безліч баластних речовин, у тому числі і інших білків. Крім того, більшість ферментних препаратів є комплексними, тобто окрім основного ферменту, що має найбільшу активність, до його складу входять інші супутні ферменти. Проте існують препарати й індивідуальних ферментів. 

Застосування ферментних препаратів в галузях харчової промисловості дозволяє інтенсифікувати технологічні процеси, покращувати якість готової продукції, збільшувати її вихід, а також заощадити цінну харчову сировину. 

Ферментні препарати повинні задовольняти вимогам, що пред'являються конкретними технологіями не лише за типом каталізованої реакції, але і відносно умов їх дії : рН, температури, стабільності, присутності активаторів і інгібіторів, тобто тих чинників, які зумовлюють ефективність дії препарату в цьому середовищі і дозволяють правильно визначити технологічні режими його застосування. 

В залежності від мети застосування до ферментних препаратів пред'являються певні вимоги не лише відносно складу ферментів і оптимальних умов їх дії, але і відносно ступеня очищення, вживаних наповнювачів, вартості і ряду інших параметрів. 

Дуже важливим моментом є оцінка безпеки ферментних препаратів, і в першу чергу це стосується мікробних ферментних препаратів, які вимагають ретельного хімічного, мікробіологічного і токсикологічного контролю. Особливе місце займають ферментні препарати, що отримуються з генетично модифікованих мікроорганізмів. Основними ферментними препаратами, отриманими методами генної інженерії і дозволеними до застосування в харчовій промисловості, є: α-амилаза з В.stearothermophilys, експресована у В.subtilis; α-амілаза з В.megaterium, експресована у В. subtilis; хімозин А, отриманий з штаму Е.coli К-12, що містить ген телячого прохімозину А. 

Нині у світі виробляється велика кількість ферментних препаратів для різних галузей харчової промисловості, що використовуються на різних стадіях технологічного процесу. Різні фірми випускають ферментні препарати під різними комерційними (торговими) назвами. Проте робота з пошуку нових продуцентів, створенню нових препаратів пролонгованої дії, очищенню ферментних препаратів, підвищенню їх стабільності і т. п. ведеться дуже інтенсивно.

Продуценти та їх культивування

До мікроорганізмів – продуцентів ферментів – пред'являються наступні вимоги: наявність високої ферментативної активності; переважний синтез ферменту або групи ферментів, що діють на певний субстрат; генетична стабільність за ознакою синтезу ферменту або ферментів; досить висока швидкість росту; здатність рости на середовищах з доступними і недорогими джерелами живлення.

Культивування продуцентів ферментів проводяться в умовах стерильності (глибинний процес) або максимально можливого наближення до них (твердофазний процес).

Ферментна промисловість випускає великий асортимент препаратів мікробного походження, продуцентами яких є представники різних таксономічних груп. Велика частина валової кількості ферментів, особливо гідролітичних, виробляється на основі культивування бацил (передусім B. subtilis), мікроскопічних грибів p.p. Aspergillus, Penicillium, Trichoderma, а також актиноміцетів p.p. Acyinomices, Streptomices. Найчастіше використовують мезофільні штами аеробних мікроорганізмів.

Переважаючим способом культивування є глибинний, заснований на вирощуванні продуцентів в стерильних рідких середовищах з примусовою аерацією(для аеробних форм) і перемішуванням середовища, за автоматичного регулювання параметрів процесу, таких як температура, рН середовища, її редокс-потенціал, концентрація розчиненого кисню і ін.

Разом з глибинним застосовується твердофазний спосіб культивування, коли культури продуцентів вирощують на зволожених і простерилізованих твердих середовищах, таких як висівки, буряковий жом, подрібнену целюлозовмісну сировину, солодові паростки та ін. Твердофазне культивування складніше регулювати, ніж глибинний процес. Перевагою твердофазного процесу є те, що умови культивування максимально наближені до природних, в яких повністю реалізується біопотенціал мікроорганізмів.

Твердофазна культура добре аерується. У кінці ферментації отримують культуру у формі, зручній для виділення ферментних препаратів.

Глибинне культивування використовується як для аеробних, так і для анаеробних продуцентів, твердофазное – тільки для аеробних, саме для мікроскопічних і вищих базидальних грибів.

Одержання ферментних препаратів

Ферментна промисловість випускає препарати різного ступеня очищення. Багато видів вітчизняних ферментних препаратів мають назви і індекси. Назва ферментного препарату включає назву основного ферменту і назву мікроорганізму-продуцента, із закінченням "-ин". Наприклад: амілоризин – основний фермент – амілаза, продуцент Aspergillus oryzae; протосубтилін – основний фермент – протеаза, продуцент Bacillus subtilis. Окрім цього, в назві обов'язково відбивається спосіб культивування мікроорганізму : Г – глибинне; П – поверхневе, а також ступінь очищення – X(2Х; 3Х; 10Х; 15Х; 20Х). 

Індексом ГХ позначається неочищена культуральна рідина продуцента ферменту. Препарати ГХ використовуються переважно на місці вироблення. Так, в спиртовому виробництві застосовують культуральну рідину продуцентів амілолітичних і целюлітичних ферментів, що отримуютья у ферментних цехах спиртзаводів.

У харчових виробництвах препарати ГХ придатні лише в технологічних процесах, де виключено попадання препарату в готовий продукт, наприклад, у виробництві спирту, де ферментні препарати видаляються з продукту в процесах відгону і ректифікації.

Препарати з індексом Г3Х отримують шляхом розпилювального висушування концентрованої культуральної рідини. Концентрація проводиться методом вакуум-випарювання за температури, що не викликає інактивації ферментів (зазвичай не вище 30°С).

Препарати з індексом Г3Х є неочищеними. Вони мають високий ступінь мікробного обсіменіння. Це обмежує сферу їх застосування. У харчовій промисловості препарати Г3Х використовуються в тих же технологіях, що і ГХ. У сільському господарстві препарати Г3Х широко застосовуються для обробки кормів з метою підвищення їх засвоюваності.

Індекс Г10Х мають препарати, отримані шляхом осадження органічними розчинниками з концентрованих фільтратів культуральної рідини. Перед фільтрацією культуральну рідину обробляють мінеральними або органічними коагулянтами, що дозволяє в процесі розділення фаз звільнити фільтрат від біомаси мікроорганізмів, баластних білків, полісахаридів, нуклеїнових кислот. Фільтрат концентрують вакуум-випаровуванням, додаючи за необхідності стабілізуючі агенти.

Препарати Г10Х мають значно більш високу чистоту, ніж ГХ, Г3Х. Сфера застосування препаратів Г10Х охоплює різні харчові виробництва, галузі легкої і хімічної промисловості.

Препарати з індексом Г20Х отримують із застосуванням ультрафільтрації – способу концентрації, заснованої на розділенні речовин з різною молекулярною масою за допомогою напівпроникних мембран з певним розміром пор. Ультрафільтрації піддають заздалегідь очищені ферментні розчини, вільні від клітин мікроорганізмів і зависі.

З ультраконцентратів отримують рідкі і сухі форми ферментних препаратів. Рідкі форми стабілізують консервантами, наприклад, бензойною кислотою. Сухі форми отримують шляхом розпилювального висушування. Перед висушуванням в концентрат вносять стабілізатори і наповнювачі.

Препарати Г20Х застосовують у виробництві харчових продуктів і напоїв, в кормовиробництві, у складі лікарських засобів для лікування захворювань, пов'язаних з ферментною недостатністю.

Препарати з індексом Пх є висушеними культурами грибів –  продуцентів ферментів, отриманими під час твердофазного культивування. Препарати Пх зберігають повний ферментативний комплекс продуцентів. Вони є неочищеними і мають високе мікробне обсіменіння. Застосовуються аналогічно препаратами ГЗх.

Препарати з індексами П10Х і П25Х отримують зі свіжих або висушених твердофазних культур грибів за наступною схемою: водна екстракція ферментів з культури гриба, відділення екстракту, осадження ферментів з екстракту етиловим або ізопропіловим спиртом, відділення ферментного осаду, суспендування осаду у воді, добавляння до суспензії стабілізаторів і наповнювачів, розпорошувальне висушування. Препарати П10х застосовуються аналогічно Г10Х, П25Х – аналогічно Г20Х.

Препарати з індексом П20Х отримують за схемою: екстракція ферментів з твердофазної культури, стерилізуюча фільтрація екстракту, ультрафільтрація, стандартизація і стабілізація ультраконцентрату розпилювальне висушування. Препарати застосовують аналогічно Г20Х.

Перераховані види ферментних препаратів відносяться до так званих розчинних, тобто до препаратів, активна частина яких розчиняється у водному середовищі. Після закінчення ферментативної обробки субстрату розчинний препарат залишається в реакційному середовищі і повторно не використовується.

Разом з розчинними випускають також іммобілізовані ферменти. Іммобілізація – це включення об'єкту в ізольовану фазу, яка відокремлена від фази вільного розчину, але здатна з нею обмінюватися молекулами (субстратів, ефекторів).

Іммобілізовані ферменти отримують шляхом з’єднання з носіями розчинних ферментів або клітин мікроорганізмів, що мають ферментативну активність. Найбільш поширені способи з’єднання – це сорбція на носії (наприклад, у ферментному препараті іммобілізованого папаїну носієм є нейлонове полотно), ковалентне з’єднання і включення в структуру гелів-носіїв.

Іммобілізація наближає умови функціонування ферментів до природних. У природі велика частина ферментів асоційована із структурами живих організмів або елементами довкілля, що важливо для прояву активності ферментів і їх стабільності.

Іммобілізовані ферменти мають ряд переваг перед розчинними під час проведення процесів промислового біокаталізу. Іммобілізовані ферменти можна вилучити з реакційного середовища, що дозволяє контролювати хід ферментативної реакції і багаторазово використовувати ферментні препарати. Каталітичний процес можна проводити безперервно, пропускаючи розчини субстратів через реактори з іммобілізованими ферментами. Продукти реакції не забруднюються домішками ферментних препаратів. Іммобілізовані ферменти мають високу операційну стабільність, а їх каталітичні властивості можна модифікувати, змінюючи спосіб з’єднання і вид носія.

Застосування іммобілізованих ферментів дозволило вирішити задачу створення великих промислових біокаталітичних процесів, за допомогою яких роблять амінокислоти, органічні кислоти, органічні розчинники, метан, антибіотики, гормональні препарати, роблять очищення стічних вод і водойм, біоконверсію органічних відходів.